干货满满 | 常用细胞凋亡常用检测方法

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干货满满 | 常用细胞凋亡常用检测方法 by 生信兔子

细胞凋亡（Apoptosis）是一种有序的或者程序性的细胞死亡方式，是细胞受到特定基因调控后的主动性死亡过程，也是正常的细胞生理应答反应，凋亡的细胞最终将被体内吞噬细胞处理。

通常可分为3个阶段。细胞凋亡初期是细胞的间接触消失，但是胞膜尚完整，粗面内质网上的核糖体脱落，细胞核出现固缩表现，本阶段持续时间很短；细胞凋亡中期是细胞核碎裂后与细胞内的各种细胞器结合，并进一步被质膜包裹形成凋亡小体；凋亡晚期是吞噬细胞吞噬凋亡小体，并将其消化为重新供机体使用。

图1：细胞凋亡的不同阶段

细胞凋亡的机制

（1）细胞凋亡的死亡受体途径及调控：死亡因子受体(Fas)/死亡因子Fas配体( FasL)死亡通路 ；TNFR 死亡通路。

（2）线粒体途径及调控。

（3）内质网通路：CHOP通路；JNK 通路；Caspases 12通路。

（4）端粒酶途径的细胞凋亡。

（5）NO参与的细胞凋亡反应。

常用的细胞凋亡检测方法有以下几种：

1. 形态学检测

“凋亡”最早是一个细胞形态学概念。因此，鉴定凋亡的金指标，往往是基于形态学的。

凋亡和另外一种主要的细胞死亡类型“坏死”（Necrosis）有着显著的亚细胞形态差异。简而言之，在透射电镜下，凋亡细胞染色质浓聚，通常沿核膜分布；整体细胞形态发生变化，如细胞表面微绒毛状突起消失，细胞间接触消失，细胞质浓聚，形成具有膜结构的包裹着胞浆内容物和核物质的凋亡小体；相比坏死，凋亡细胞的核结构直到晚期才会解体。典型图片如下图：

图2：电镜下，Jurkat细胞凋亡时核染色质的形态变化

尽管电镜检查是鉴定凋亡的金标准，然而其缺点也很明显：无法定量（电镜一个视野仅能观察一两个细胞），实验步骤繁琐（固定、切片到拍照），同时，并非所有实验室都能接触到电镜。因此，对于不专门研究凋亡这种细胞现象的实验室来说，基本没有人选择电镜来检测凋亡了。好在目前的主流期刊，也是接受不含电镜的凋亡数据（当然也是看文章的主角是否为凋亡）。

2. 用的最多的Annexin V /PI双染色法检测早期凋亡

图3 Annexin V /PI染色原理

正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS会从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的Annexin-V作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI结合使用，就可以检测出细胞群体中的早期凋亡细胞与晚期凋亡细胞。

图4：Annexin V /PI双染色法检测的原理。B3象限：Annexin V-/PI-：活细胞；B4象限：Annexin V+/PI-：早期凋亡细胞；B2象限：Annexin V+/PI+：晚期凋亡细胞；B1象限：Annexin V-/PI+：坏死细胞。

3. 细胞凋亡—活化的Caspase-3检测 

Caspase-3 正常以酶原（32 KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17 KD）和两个小亚基（12 KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，Caspase-3 的活性明显下降。

其主要原理可以分为两大类：检测Caspase剪切体的含量，以及检测Caspase的活性。

检测含量就不多讲，无非就是用抗体去做Western blot，免疫组化或免疫荧光，进行定性或相对定量。而由于激活的Caspase是一种蛋白酶，因此许多公司也设计出了能够被Caspase特异识别的短肽，并在切割后产生信号，从而指示酶活。

图5：Caspase家族在凋亡过程中的作用

4. Tunel检测法

此外，围绕DNA断裂的检测方法还有脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal-Deoxynucleotidyl Transferase Mediated Nick End Labeling,TUNEL），即Tunel检测法。细胞凋亡时DNA双链或单链断裂会产生大量的粘性3’-OH末端。以此为线索，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）协助下，将生物素/荧光素标记的dUTP绑定在3’-OH末端，并通过酶联显色或荧光检测来定量分析结果。

      

图6：Tunel检测法示意图 

5. DNA损伤检测

细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩，染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂，形成180~200bp整数倍的寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱（DNA ladder）。通过提取DNA、电泳、UV下可见DNA ladder。此方法是判断细胞有无凋亡发生的一种简便方法，比较适用于体外培养的非增殖性细胞的检测。

图7 泳道1：DNA ladder，泳道2-3：坏死，泳道4-6：凋亡，泳道7：正常细胞

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