从NC中学习利用单细胞多基因负荷评分识别细胞类型

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从NC中学习利用单细胞多基因负荷评分识别细胞类型 by 作图丫

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     极度近视（EM）定义为球形等效（SE）≤−10.00屈光度（D），是视力障碍的主要原因之一。已知的 EM 相关变异只能解释有限的风险，不足以进行临床决策。为了发现风险基因，我们对449名EM个体和9606名对照进行了全外显子组测序（WES）。我们在EM病例中发现罕见的蛋白质截短变体（PTV）显着过量，富含逆行囊泡介导的运输途径。采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞多基因负荷评分（scPBS），我们将PI16 + / SFRP4 +成纤维细胞确定为最相关的细胞类型。我们观察到 KDELR3 在巩膜成纤维细胞中高度表达并参与巩膜细胞外基质（ECM）组织。斑马鱼模型显示，kdelr3 下调导致眼轴长度延长和晶状体直径增加。总之，我们的研究提供了对人类 EM 遗传学的见解，并强调了KDELR3在EM发病机制中的作用。

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背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，作者使用全外显子组关联研究发现极度近视中的KDELR3突变。文章发表在《Nature Communications》上，文章题目为：Exome-wide association study identifies KDELR3 mutations in extreme myopia。

结果解析

01  外显子组测序可识别 EM 病例的诊断突变

经过严格的质量控制，我们在发现阶段使用了来自 449 名受 EM 影响的个体和 9606 名健康对照的 WES 数据。共有 2,543,192 个变异用于进一步分析，包括 50,470 个常见变异 （次要等位基因频率，MAF > 5%）、40,541 个低频变异 （0.5% < MAF < 5%） 和 2,452,077 个罕见变异（MAF<0.5%）。我们首先量化了75个特征明确的近视相关基因中潜在致病性变异对 EM 的贡献率（定义为病例百分比）。按照美国医学遗传学和基因组学学院 （ACMG） 的指南，通过人工审查评估这些已知基因的变异致病性。在已知基因中检测到的 2684 个变异中，在 21 个已知基因中鉴定出27P/LP变异。包括20个（74.1%）PTV和7个（25.9%）错义变体。在27P/LP变体中，其中13个（48.1%） 在gnomAD数据库中不存在，只有一个变体的 MAF > 0.05%;所有变体的 PHRED 标度CADD评分均大于20。在这些基因中，CEP290 在病例中占致病等位基因的比例最高，据报道会导致 Bardet-Biedl 综合征和Leber先天性黑朦伴早发性视网膜变性。

在 41 名患者中检测到已知近视基因中的 P/LP 变异，对我们的EM队列产生了 9.13% 的贡献。其中大多数（39/41， 95.12%） 携带单等位基因是单个杂合 P/LP 变体（图 D）。CEP290、RP1 和 LTBP2 是我们队列中排名前三的潜在 EM 致病基因（>5%）。全身综合征、眼综合征和非综合征性近视相关基因在基因检测中分别占 31.70%、60.98% 和 7.32%（图使用功能富集分析，我们对已知近视基因与基因本体定义的生物过程之间的关联进行了分类。视觉感知 （GO：0007601;P = 3.69 × 10−49）、眼睛发育 （GO：0001654;P = 4.54 × 10−17）、细胞外基质组织 （R-HSA-1474244;P = 2.15 × 10−14） 和视网膜稳态 （GO：0001895;P = 1.30 × 10−9） 富集，这可能有助于 EM 的不同机制（补充数据 5）。值得注意的是，9 个与眼睛发育有关的基因占检出病例的最大比例 （23/41， 56.10%），包括 CEP290、RP1、EPHA2、BBS7、WDPCP、PAX2、COL2A1、COL18A1 和 SCO2 。此外，6 个基因负责细胞外基质组织 （EPHA2、COL9A2、PAX2、COL2A1、LTBP2 和 COL18A1），并且在已知基因中也占了相当大的比例（10/41， 24.39%）。与以前的研究结果一致，在已解决的 EM 病例中，巩膜中表达的基因和光感受器（视锥细胞和视杆细胞）中表达的 9 个近视相关基因的比例分别为 21.95% 和 56.10%。

02  使用单细胞基因表达推断 EM 的相关细胞类型

利用罕见变异的多基因负荷来识别 EM 相关细胞类型。为了可靠地识别 EM 隐含的细胞类型，我们使用了两种方法，以预定义的细胞类型分辨率和单细胞分辨率将 scRNA-seq 与 EM 中罕见变异的多基因负担联系起来。我们利用来自人类胚胎眼23 的广泛细胞类型的基因表达数据，系统地将 EM 映射到细胞类型（图 2）。对于细胞类型水平，我们测试了每种细胞类型中前 10% 的标记基因是否在 EM 病例中富集稀有 PTV 的负荷 （补充数据 11）。我们发现成纤维细胞 （P = 0.050） 和黑色素细胞 （P = 0.042） 的最强信号与 EM 显著相关（图2d，补充数据 12）。未观察到与神经元和神经胶质细胞的显着关联。同义变体的负担检验表明，病例队列和对照队列之间的背景率没有显着的膨胀。总之，我们已经表明细胞类型水平的基因表达可以识别 EM 的相关细胞类型。

为了表征每种细胞类型中相当大的异质性，我们应用了基于MAGMA的单细胞富集方法 scDRS24，以识别具有上述ExWAS的EM相关细胞类型和亚群。然而，在 MAGMA 分析中没有基因与 HM 显著相关。scDRS 未鉴定具有显著个体细胞水平疾病关联的EM相关细胞。因此，我们在MAGIC工具包 （https://github.com/sulab-wmu/MAGIC）中引入了单细胞多基因负荷评分 （scPBS），这是一种评估 scRNA-seq 数据单个细胞中罕见变异的多基因负荷富集的方法。scPBS 评估给定细胞在 EM 病例中是否具有过量的稀有 PTV，这些 PTV 来源于 scRNA-seq 的细胞特异性高表达基因。scPBS 由三个步骤组成，通过平均性状相关基因的表达水平来输出每个细胞的基于稀有变异的性状相关评分（rvTRS）。来自人胚胎眼的EM细胞的rvTRS显示在低维均匀流形近似和投影 （UMAP） 空间中。值得注意的是，与EM相关的细胞谱系产生了相当高的 rvTRS，这表明 scPBS 很好地捕获了这些罕见变异遗传效应的细胞特异性（图 D）。与上述预定义的细胞类型分辨率一致，我们发现scPBS鉴定出rvTRS增加的成纤维细胞区室。EM 相关成纤维细胞亚群具有高表达基质成纤维细胞标志基因（PI16+ 和 SFRP4+）。scPBS 鉴定出 PI16 + / SFRP4 + 成纤维细胞表现出 EM 风险的 rvTRS 增加。总之，这些发现提供了遗传证据，支持成纤维细胞亚群，即 PI16+/SFRP4+ 成纤维细胞参与EM疾病的病因学。

03  基于基因的罕见变异关联分析

为了识别与 EM 相关的基因，我们进行了一项关联分析，其中根据 MAF < 0.5% 的罕见有害变异的存在与否对个体进行分类，同时考虑我们的队列和来自 gnomAD 的数据。罕见的 PTV 模型包括总队列（病例和对照）中鉴定的 6,335 个基因的 12,384 个变异。因此，我们将使用双侧 FET P 值将 Bonferroni 校正的 P 值为 0.05/6335 = 7.89 × 10-6 的外显子组范围显着性阈值。与 EM 显著相关的基因包括 KDELR3 （OR = 15.82，P = 7.27 × 10-7）和 VN1R4 （OR = 10.89，P = 1.49 × 10-6;无花果。分位数-分位数图表明，仅在最低的 P 值下，系统偏差和与原假设的偏差得到了很好的控制。为了验证具有 EM 关系的排名靠前的基因，我们对 DisGeNET27 的前 100 个候选基因和疾病相关基因进行了富集分析，发现 393 个失明相关基因在前 100 个候选基因中显著富集 （5.4 倍富集，P = 0.00032;补充数据 15）。坍缩分析中的前 10 个基因列在图 1 中。折叠分析中最强的信号是由 KDELR3 基因座的变异产生的，其中 8 例/449 例具有 3 个罕见 PTV （1.8%），而 9606 例对照中只有 11 例具有罕见 PTV （0.1%）。没有病例在已知近视基因的 KDELR3 或 P/LP 变体中具有罕见的 PTV。为了比较病例对照负担，同时考虑罕见编码变异导致的效应大小和方向的潜在混合，以及10个PC对群体分层的影响，我们进行了罕见变异关联研究的 SKAT-O，发现KDELR3具有外显子组范围的显着信号。

小编总结

我们报告了迄今为止进行的最大规模的 WES EM 研究，并提供了其遗传景观的详细特征。我们采用 ACMG 标准38 对变异致病性进行分类，并使用来自大型对照群体的统一处理数据，以最大限度地减少可能亚群的假阳性。根据75个已知的致病基因，最终在65%的EM患者中鉴定出22.7P/LP 变异。尽管取得了这些进展，但超过75%的EM患者的遗传缺陷仍然未知，因为同步筛查所有致病基因一直具有挑战性。

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