单细胞分析揭示动脉粥样硬化斑块的基因表达图谱

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单细胞分析揭示动脉粥样硬化斑块的基因表达图谱 by 单细胞天地

文章概述

文章标题：《Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution》

发表日期和杂志：2022年发表在Communications Biology上

在线阅读链接：https://doi.org/10.1038/s42003-022-04056-7

研究背景：

动脉粥样硬化（Atherogenesis）的发生涉及炎症、组织重塑和细胞转分化（CTD）的相互作用，这使得精确描述其病理生理学特别困难。

单细胞数据详情

研究方法：

使用单细胞RNA测序（scRNAseq）和系统生物学方法来分析血管平滑肌细胞（VSMCs）和内皮细胞（ECs）的转录谱。

研究对象：

钙化动脉粥样硬化核心（AC）斑块和患者匹配的近端相邻（PA）颈动脉组织，这些样本来自接受颈动脉内膜切除术的患者。

数据链接是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE159677

单细胞数据详情：

GSM4837523 Patient 1 AC scRNA-seq
GSM4837524 Patient 1 PA scRNA-seq
GSM4837525 Patient 2 AC scRNA-seq
GSM4837526 Patient 2 PA scRNA-seq
GSM4837527 Patient 3 AC scRNA-seq
GSM4837528 Patient 3 PA scRNA-seq

GSM4837523_02dat20190515tisCARconDIS_featurebcmatrixfiltered.tar.gz 71.1 Mb
GSM4837524_01dat20190515tisCARconHEA_featurebcmatrixfiltered.tar.gz 25.4 Mb
GSM4837525_02dat20190620tisCARconDIS_featurebcmatrixfiltered.tar.gz 87.2 Mb
GSM4837526_01dat20190620tisCARconHEA_featurebcmatrixfiltered.tar.gz 33.7 Mb
GSM4837527_02dat20190717tisCARconDIS_featurebcmatrixfiltered.tar.gz 81.5 Mb
GSM4837528_01dat20190717tisCARconHEA_featurebcmatrixfiltered.tar.gz 25.9 Mb

给的是tar.gz格式的压缩文件，选择需要的数据下载之后将其解压开来就会得到整理好的10X标准三文件，然后用Read10X_h5()函数读取，创建seurat对象进行后续的降维聚类分群即可

主要分析结果

单细胞降维聚类分群

• 从三名患者的配对AC和PA样本中生成的单细胞总数为51,981个，平均每名患者约有13,000个AC细胞和5000个PA细胞。 AC和PA细胞数量的差异是由于AC与PA组织本身大小的差异所致。

• 由于AC细胞相对于PA细胞的数量较多，所以进行了下采样，以平衡每个样本和条件对无监督细胞类型发现的贡献，并减少由于类别不平衡引起的偏差。

• 使用UMAP聚类方法对下采样数据集进行分析，揭示了15个不同的细胞分区，共代表17,100个细胞。

• 为了将分区分配给主要的细胞类型，检查了每个分区中表达超过80%的细胞和平均表达计数大于2的基因，每个分区选择了三个标记基因

• 基于这些标记基因，为这15个初始分区分配了细胞类型标签，包括：T淋巴细胞（2个分区）、巨噬细胞、VSMCs（2个分区）、ECs（2个分区）、B淋巴细胞、自然杀伤T细胞、B1淋巴细胞、肥大细胞、淋巴样祖细胞、浆细胞样树突状细胞，以及一个未识别的分区

• 使用标记基因排除法进行双重过滤，移除了细胞数量太少无法进行差异基因表达分析的分区（肥大细胞、淋巴样祖细胞、浆细胞样树突状细胞和未识别的分区），并将分配给相同细胞类型的分区合并。

主要鉴定出了巨噬细胞、ECs、VSMCs、NKT细胞、T细胞和B细胞，评估了AC和PA区域之间的差异基因表达

VSMCs和ECs的差异基因表达

genome-wide association studies（GWAS）的结果强调了血管壁中的生物学过程是冠状动脉疾病（CAD）的关键驱动因素，之前的工作已经证明血管壁参与了CAD最常见的遗传风险因素。

与其它细胞类型相比，血管平滑肌细胞（VSMCs）和内皮细胞（ECs）在不同解剖位置显示出广泛的差异表达，所以专注于剖析这些细胞类型中的表达变化，以揭示这些细胞类型中的病理基因组特征。

血管平滑肌细胞（VSMCs）差异分析

差异表达基因展示了AC和PA细胞之间在空间和表达量上的差异，以及每个细胞类型中差异表达最多的基因

• 在UMAP图中，VSMCs形成了三个亚群。大部分PA VSMCs形成了一个特定的PA亚群，而AC VSMCs形成了两个独立的亚群，这两个亚群与PA VSMCs交织在一起。这表明VSMCs占据了三种主要的细胞状态，包括一个完全独特的PA亚型和两个主要是AC VSMCs。

VSMCs

• AC VSMCs中上调基因的空间聚类表明存在不同的基质分泌VSMCs亚群，这些亚群参与了细胞外基质（ECM）重塑。这些基因包括SPP1、SFRP5、IBSP和CRTAC1。

AC VSMCs中特定基因的功能：

• SPP1（骨桥蛋白）是一种分泌型糖蛋白，参与骨重塑，并在动脉粥样硬化中通过抑制血管钙化和炎症发挥作用。
• IBSP（骨唾液蛋白）是骨、软骨和其他矿化组织的重要成分。
• CRTAC1是区分软骨细胞与成骨细胞以及其他间充质干细胞的标记物。
• SFRP5是一种脂联素，直接拮抗WNT信号，减少炎症因子的分泌，对动脉粥样硬化的发展有积极影响。

PA VSMCs中上调基因：

• 与AC VSMCs相比，PA VSMCs在UMAP图的PA特定区域中上调的基因更为普遍。其中包括C3和PLA2G2A。
• C3在许多PA细胞中高度差异表达，与动脉粥样硬化中补体激活的角色有关，补体激活部分依赖于C3介导的巨噬细胞招募和抗体反应的激活。
• PLA2G2A（磷脂酶A2 IIA组）是促动脉粥样硬化的，调节LDL氧化和细胞氧化应激，并促进炎症细胞因子的分泌，进一步促进这一组VSMCs的炎症特性。

AC中的VSMCs表现出增加的钙化和ECM重塑，而PA中的VSMCs则表现出促炎症信号

内皮细胞（ECs）差异基因表达分析

ECs

• 与VSMCs相比，ECs在UMAP图中显示出更完全的分离，形成两个不同的亚群。PA ECs的数量显著多于AC ECs，可能由于晚期疾病中的内膜侵蚀和内皮细胞层完整性的丧失，导致在AC中捕获的ECs数量减少。

ECs

• AC ECs中上调基因的表达变化幅度更大。AC中前四个上调基因是ITLN1、DKK2、F5和FN1，而PA中是IL6、MLPH、HLA-DQA1和ACKR1。

AC ECs的功能：

• AC ECs中上调的基因表明它们具有合成特性。ITLN（omentin）是一种增强脂肪细胞胰岛素敏感性的脂肪因子，其循环血浆水平与颈动脉内膜-中层厚度呈负相关，能够抑制TNF诱导的血管炎症，并促进血管再生，表明在AC ECs中具有抗炎和内膜修复作用。
• DKK2进一步表明内膜修复，因为它刺激ECs的血管生成。
• FN1（纤维连接蛋白）的显著上调进一步表明ECM重塑活跃，并可能作为间充质细胞和EMT相关过程的标志。

PA ECs的功能：

• 与PA VSMCs类似，PA ECs中上调的基因总体上表明了炎症特性。PA ECs中特异性上调的炎症和抗原呈递的关键因子包括IL6和ACKR1。
• IL6是一种与斑块相关的主要炎症细胞因子。
• ACKR1在许多PA ECs中高度上调，它结合并内化多种趋化因子，并促进它们在细胞表面的呈递，以增强白细胞的招募和炎症。
• 通过HLA-DQA1（MHC II类分子）在ECs上的抗原呈递可能支持CD4+ T细胞的激活和耗竭。

AC中的合成型ECs，似乎参与内膜修复、血管再生和ECM调节；PA区域的炎症型ECs可能通过抗原/趋化因子呈递和免疫细胞（包括CD4+ T细胞）的招募促进炎症。

基因集富集分析

使用GSEA来评估在VSMCs和ECs中显著改变的标志性过程，以进一步探索这两种细胞类型的解剖学差异。

AC区域的VSMCs和ECs：

• 在动脉粥样硬化核心（AC）区域的VSMCs和ECs中，上皮-间充质转化（EMT）、氧化磷酸化和肌生成基因上调这三个过程显著富集，这些富集的过程共同表明细胞代谢活动和增殖增加。

PA区域的VSMCs和ECs：

• 与AC区域相比，近端相邻（PA）区域的VSMCs和ECs显示出明显的炎症特征，在这些细胞群体中，IFNγ/α反应和通过NFkB的TNFα信号是主要的富集过程。

EMT标志性基因的分析进一步支持AC区域VSMCs存在两种细胞亚型的观点，它们根据收缩性基因（如MYL9、TPM2、TAGLN、FLNA）与合成/EMT基因（如POSTN、LUM、FBLN2、DCN、PCOLCE2、MGP、COL3A1）的表达差异，形成两个不同的细胞群。

这些结果表明，AC中的一组VSMCs可能执行血管壁的收缩功能，而另一组VSMCs可能参与细胞转分化（CTD）和细胞外基质（ECM）重塑。

文章小结

• PA细胞表达炎症介质，而AC区域的细胞主要表达基质分泌基因。
• 系统生物学分析表明，PA ECs和VSMCs中的炎症可能由TNFα信号驱动。
• 识别了AC VSMCs中的POSTN、SPP1和IBSP，以及AC ECs中的ITLN1、SCX和S100A4作为动脉粥样硬化核心中CTD的潜在驱动因子。

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