单细胞手动注释Marker基因，附注释思路

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单细胞手动注释Marker基因，附注释思路 by 光热生物

 

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为什么采用手动注释？

尽管自动细胞注释方法方便且系统化，但它们需要一个适当的参考数据库，并且并不总是产生高置信度注释。当这些方法导致置信度较低、细胞标签冲突或缺失时，需要专家手动注释。专家手工注释通常被视为细胞注释的最佳方法。就个人观点，自动注释适合作为方法学研究（开发自动注释算法），而手动注释更适合一般研究。

怎么手动注释？

如果一个已知细胞类型的许多标记基因在集群中的细胞中高度表达，这通常足以支持将其标记为该细胞类型。为方便起见，手动注释通常在簇级别操作，但罕见的细胞可以单独检查。

手动注释局限性是什么？

缓慢、低效率，并且可能是主观的。

手动注释Marker基因

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CellType _	Marker	Marker	Marker	Marker
免疫细胞	PTPRC
T cell _	CD3D
CD4+T	CD3D	CD4
CD8+T _	CD3D	CD8A	GZMK
NK	KLRD1	GNLY

B _	CD79A	MS4A1
Plasma	SDC1	IGHG1	MZB1	TNFRSF17
Myeloid _	LYZ	CST3	CD14	CD68
Fibroblast	COL1A1	DCN	PDGFRA
Endothelial _	CLDN5	CDH5
T Proliferative	MKI67

T Regulatory _	FOXP3
T Exhausted	TIGIT	LAG3	HAVCR2	PDCD1
T Naive _	CCR7
T Memory	IL17RA
上皮/Tumor _	EPCAM	KRT18	KRT19
干细胞-like	ALDH1A1
Mast _	TPSAB1	TPSB2

总体思路

首先，我们得先确定这个细胞的笼统细胞类型：

表达“PTPRC”，则为免疫细胞，不表达则不是。

其次，我们根据特异性谱系基因或转录因子确定精细细胞类型：

表达“CD3D”,“CD3E”,“CD3G”为T细胞；

表达“CD79A”,“MS4A1”为B细胞；

表达“TNFRSF17”,“SDC1”为浆细胞；

表达“COL1A1”,“DCN”,“PDGFRA”为纤维细胞；

表达“CLDN5”,“CDH5”为内皮细胞等等；

最后，根据高表达的标志物阐述细胞功能：

表达“GZMB”,“PRF1”为溶细胞活性；

表达“FOXP3”为调节性；

表达“PDCD1”,“HAVCR2”,“LAG3”等等免疫检查点为耗竭性；

表达“SELL”,“CCR7”则为naïve；

表达“CD69”则为Activated

手动注释没有固定的模式，可以先笼统注释，再提取亚群精细注释

特别需要注意什么？

髓系我在上面采用了笼统注释，具体标志物非常复杂，反复check髓系注释是否准确：髓系标志物ITGAM

巨噬细胞：巨噬细胞也属于天然免疫系统细胞，并且通过 CD68 和 MHCII 表达以及 CD11c 的缺乏便可检测到。它们专门负责吞噬，并且还会分泌影响免疫反应的细胞因子。巨噬细胞一般划分为促炎（M1样）或抗炎（M2样）细胞。巨噬细胞不表达ITGAX。

M1样巨噬细胞可通过CD80、CD86 或 NOS2 的表达而被鉴定出，并且可通过恶性细胞的吞噬以及 T 细胞激活配体的产生来促进抗肿瘤免疫反应。

M2-样巨噬细胞可通过 CD163 或 CD206 表达被鉴定出，并且能通过分泌免疫抑制细胞因子（例如IL-10）以及促进 Th2反应来促进肿瘤生长。M2 巨噬细胞还表达免疫抑制酶精氨酸酶，这种精氨酸酶会耗竭肿瘤微环境中的精氨酸，从而导致T 细胞增殖和功能减弱。

单核细胞：在表达髓系标志物ITGAM的基础上且“CD14”阳性的基础上，但不表达M1和M2细胞的标志物。单核细胞的固有标志物是CD14，人可以用CD16（ FCGR3A）来区分不同亚型：经典型单核细胞标记为CD14+CD16-；中间型单核细胞标记为CD14+CD16+；非经典型单核细胞标记为CD14+CD16++

肿瘤细胞怎么办？

我以前在做肺癌单细胞注释的时候注意到，肿瘤标志物和正常上皮标志物十分接近，因此，我们可以采用inferCNV去判断该簇细胞是否为肿瘤细胞，如果有大片的拷贝数缺失或增加，显然是肿瘤细胞。注意，参考细胞不要选择浆细胞。

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