文献精读 | 眼内类淋巴系统参与啮齿类动物眼内β淀粉样蛋白的清除

[ixxmu]

https://mp.weixin.qq.com/s/QteIPYZXDarSGPGGG7pY7g

[ixxmu]

文献精读 | 眼内类淋巴系统参与啮齿类动物眼内β淀粉样蛋白的清除 by 山中麻署

与大脑相似，眼球的内部结构也被包含在一个有限的空间中，液体稳态调控对其而言非常必要。而他们都缺乏传统意义上的淋巴管。最新研究表明脑内存在淋巴管样功能的结构，被称为“类淋巴系统”，同时发现硬膜上是存在淋巴管的。神经影像学的研究亦证实了人类大脑中确实存在类淋巴/淋巴系统，并最终引流至颈部淋巴结。类淋巴/淋巴系统承担了β淀粉样蛋白（Aβ）（脑内淀粉样斑块和视网膜内淀粉样蛋白沉积的主要成分）的清除。

目前对于视网膜神经层调控眼内容量稳态的机制缺乏认识。研究证实脑脊液（CSF）会沿着视神经的血管周围间隙（PVS）逆向运输，而青光眼中这种逆向运输会受损。这一结果结合临床观察提示眼内可能也存在类淋巴系统。类淋巴系统的主要功能是清除代谢废物，而高度活跃的视网膜神经元不断生成代谢废物，因此清除系统的存在极其必要。

基于以上背景，该研究目的在于探索视神经是否是眼内液体的流出通道，从而促进视网膜内代谢废物的清除。

1.造影剂成像证实眼内类淋巴系统的存在

作者在小鼠玻璃体内注射HiLyte-594标记的人源β淀粉样蛋白（hAβ），1h后使用uDISCO 技术（ultimate three-dimensional imaging of solvent-cleared organs）分析小鼠眼球及头部造影剂的分布，发现除了前向路径外，hAβ还可以沿着视神经离开眼球。随后往血管内注射放射标记的K+类似物（86Rb+）或者FITC-cadaverine（能通过血视网膜屏障而不能通过血脑屏障）也证实了视神经通路的存在。

对视神经整体观察证实，hAβ沿着视神经进行前向运输。转基因小鼠（动脉和小动脉周细胞表达DsRed）的研究表明hAβ优先沿着视神经静脉的PVS聚集而不是小动脉。眼部脉络膜注射后，造影剂同样可以沿着视神经转运。眼部的高分辨率成像显示，hAβ被视网膜神经节细胞（RGC）和无长突细胞（amacrine cell）吸收，并沿着Ⅲ类β-tubulin（TUJ1）阳性的轴突进行转运。

在视神经上，少突胶质细胞和星形胶质细胞也有散在的hAβ造影剂，其信号强度在近端距离视神经乳头（ONH）274 ± 20μm处达到顶峰，越往视远端信号强度逐渐下降，表明hAβ在神经达到视交叉前即离开了视神经。视神经近段的硬膜鞘内有造影剂聚集，而硬膜及周围的疏松组织中包含有传统的淋巴管结构。在玻璃体内注射造影剂3h后，可以观察到hAβ在同侧的颈淋巴结聚集。同时在玻璃体内注射hAβ和小脑延髓池注射AF-dextran，可以观察到两种造影剂在视神经中的不同空间分布：小脑延髓池注射的造影剂主要沿着动脉和毛细血管PVS运输，而玻璃体内注射的造影剂则沿着静脉聚集。

以上结果表明玻璃体内注射的hAβ可以通过视神经轴突并沿着视神经内静脉PVS进行运输，随后在到达视交叉之前汇入视神经硬膜鞘中的淋巴管和眶淋巴管。

2.眼内Aβ清除与胶质细胞水通道AQP4有关

视网膜Müller胶质细胞大量表达AQP4。按照前述方法在Aqp4−/− 和 Aqp4+/+的小鼠中进行玻璃体内注射荧光标记的hAβ，并比较两种小鼠体内造影剂的分布。两种小鼠注射后的眼内压（IOP）并无明显差异。而Aqp4−/−小鼠，穿透视网膜的hAβ显著减少，沿着视神经而清除的hAβ也显著地减少。这些结果表明视网膜Müller胶质细胞和筛板前的星形胶质细胞上表达的AQP4促进了眼内类淋巴系统的清除功能。

3.跨筛板压力差驱动眼内Aβ的清除

压力差是液体定向流动的主要驱动力。在生理情况下，IOP超过颅内压（ICP），因此筛板两侧的压力差可能促进液体沿着视神经流动。为确定跨筛板压力差（TPD）在hAβ运输中的作用，作者通过从小脑延髓池抽出或注射人工脑脊液的方法来控制ICP并对其进行监测，这种方法并不会引起IOP的改变。在玻璃体内注射造影剂30min后，ICP降低可以引起在近端视神经中运输的hAβ的总信号强度和峰值信号强度的增加。相反，ICP增加可以显著减少hAβ沿着视神经的清除。这些结果表明：当TPD减少时，hAβ沿着视神经的运输减少，而TPD升高时则hAβ的运输增加。

4.光照诱导的瞳孔收缩增强了眼内类淋巴系统的清除功能

健康人在适应光照的过程中反复的瞳孔和睫状体收缩能促进房水流出。于是研究者猜想hAβ沿着视神经的运输受到生理条件下瞳孔收缩的影响。作者将实验小鼠分为以下几组：1）黑暗组（未加任何刺激），2）单纯1Hz光照刺激组，3）1Hz光照刺激+1%阿托品组，4）黑暗+2%毛果芸香碱组。

相比于黑暗组，在hAβ注射30min后，在单纯光照刺激条件下，总hAβ信号强度，峰值信号强度和运输的距离相比黑暗组均明显地增加。黑暗组的造影剂聚集缓慢，在2h后才能达到单纯光照刺激组的水平。作者用红外瞳孔测量法来记录瞳孔在不同组小鼠中的变化，发现单纯光照刺激组小鼠的瞳孔不断交替地收缩和扩大，而黑暗组、光照+阿托品组则没有明显的瞳孔变化。相比单纯光照组，阿托品可以阻断光照刺激下的瞳孔收缩，同时也阻断了光照刺激对hAβ运输的促进作用。而毛果芸香碱引起的瞳孔固定收缩相比黑暗组并没有影响到造影剂的运输。对IOP的测量表明，短时间内的反复光照刺激和瞳孔收缩并不会对IOP造成影响；而小鼠死后的玻璃体内注射没有发现hAβ沿着视神经运输，表明被动扩散并不会导致hAβ沿着视神经扩散。

以上结果表明反复的瞳孔收缩推动了眼内液体沿着视神经的扩散，促进了hAβ的运输。

光照刺激结合ICP控制相比单纯控制ICP并不能改变hAβ沿着视神经的运输，提示足够的压力变化能使光照刺激的作用被掩盖。而右旋糖酐的运输并没有因为增加TPD而受到影响。

5.青光眼中筛板屏障功能障碍导致

过度的病理性的类淋巴系统外流

青光眼是一组以进行性不可逆性的ONH损伤和RGC退化为特征的疾病，眼内压增加是青光眼最主要的危险因素。于是作者提出猜想：青光眼是否和眼内类淋巴系统病理性改变有关。

使用青光眼和慢性高眼压两种品系老鼠。DBA/2J小鼠会产生虹膜脱色素疾病，进而导致年龄相关的眼内压增高。在大多数DBA/2J小鼠中，慢性IOP增高导致了RGC丧失和青光眼的视神经退化。通过药物、基因或手术干预调整DBA/2J小鼠可以缓解RGC的死亡。在CD-1小鼠中，慢性环角膜缘缝合（CLS）模型通过眼压减少房水引流，增加IOP。这种模型也能造成RGC的缺失。

相比DBA/2J-Gpnmb+/SjJ小鼠（D2-control，不发展为高眼压的对照小鼠），年轻的DBA/2J 小鼠并没有表现出IOP和沿视神经的hAβ运输的差异。而50%的DBA/2J小鼠在11月龄后发展为严重的青光眼，但此时IOP通常为正常或者轻度升高，因此IOP不太可能直接影响造影剂的流出。相比同月龄的D2-control小鼠，11月龄的DBA/2J小鼠hAβ造影剂沿视神经运输显著增加，表现为hAβ总信号强度增加。类似的，在CD-1 CLS小鼠中，相比对照组，手术后一个月后hAβ的运输增加，而此时IOP已恢复正常。高分辨率共聚焦成像提示11月龄DBA/2J小鼠的视神经的hAβ主要位于PVS或者RGC轴突外，而年轻的DBA/2J小鼠和同月龄的对照小鼠的hAβ则主要分布于轴突内。

作者进一步探究筛板的胶质细胞是否具有阻碍大分子运输的屏障作用。分别向11月龄的D2-control和DBA/2J小鼠玻璃体内注射不同分子量大小（3、10、500kDa）的AF-dextran，向CLS 和假手术的CD-1 小鼠注射500kDa的AF-dextran。在对照小鼠中，小分子量的AF-dextran（3kDa，分子量与hAβ接近）并不能穿过筛板胶质细胞，而11-month DBA/2J 和CD-1 CLS 小鼠中大分子量造影剂可以在远离筛板数微米的地方检测到。共聚焦成像结果证实11月龄的DBA/2J小鼠dextran聚集在PVS或者残存的轴突外。这些观察结果表明筛板屏障在健康眼中起到转移细胞外液进入ONH轴突、促进轴突的液体转运的功能。超微电镜结构分析发现老年DBA/2J小鼠的胶质筛板屏障存在严重损害。

总结：

该研究在传统的小梁网和葡萄膜巩膜房水流出途径的基础上，发现了眼内存在的另一个液体流出系统——类淋巴系统。这一流出通道在胶质细胞水通道AQP4的帮助下，受到了TPD和光照诱导的瞳孔收缩的影响。通过对两种不同的动物模型的研究提示，眼球内液体和代谢产物通过类淋巴系统排出。在青光眼模型中，这种类淋巴通路受损。

原始文献：

Wang X, Lou N, Eberhardt A, Yang Y, Kusk P, Xu Q, Forstera B, Peng S, Shi M, Ladron-de-Guevara A et al: An ocular glymphatic clearance system removes beta-amyloid from the rodent eye. Sci Transl Med 2020, 12(536).

文   案：施翔鹏

编   辑：邱   越

审   稿：小   微