2023年10月，Nirakar Rajbhandari团队在“Cancer Cell(IF=50.3)”发表了“Single-cell mapping identifies MSI+ cells as a common origin for diverse subtypes of pancreatic cancer”，揭示了多个胰腺癌亚型来自共同的MSI2+细胞池，并为理解和控制形成胰腺癌不同命运的程序提供了一个强大的模型。
文章亮点
01
用单细胞技术解决了什么问题？
结合单细胞基因组学与发育状态和谱系轨迹的计算分析，证明MYC优先触发最不成熟的MSI2+胰腺细胞向多谱系癌症前细胞的转化。这些癌前细胞随后通过激活不同的转录程序和大规模的基因组变化来分化建立胰腺癌亚型，并强制表达特定信号，如Ras，可以重定亚型规范。
02
实验中的亮点
这项研究为胰腺癌的多个亚型提供了新模型，以单细胞分辨率追踪癌前状态的起源及其向不同的致命性恶性肿瘤的演变。
03
临床意义
为理解和控制形成胰腺癌不同命运的程序提供了一个强大的模型。作为一个重要的资源，以了解MYC的变化如何驱动肿瘤的启动和发展，并允许根据不同癌症的独特脆弱性制定早期发现和诊疗策略。
研究背景
被称为“众癌之王”胰腺癌死亡率最高，5年生存率最低。胰腺导管腺癌(PDAC)是一种侵袭性较强且常见的外分泌癌，在外分泌胰腺内，可能会发生多种其他形式的恶性肿瘤。这包括胰腺腺鳞癌(ASCP)，这是一种侵袭性的胰腺癌亚型，临床预后最差；腺泡细胞癌(ACC)，占所有儿童胰腺癌的15%，对化疗只有中等反应；以及高度侵袭性的间变性肿瘤，其特征是未分化。虽然最初被认为是罕见的，但最近的研究表明，具有混合腺鳞癌特征的PDAC比例(18%)比以前认识的要高得多。很大一部分胰腺癌可能没有正确匹配的小鼠模型，需要更好地反映疾病变异和亚型的新模型。虽然发展不像PDAC或ASCP那么快，腺泡细胞癌仍然具有高度侵袭性。因此，更好的模型可以帮助理解ACC的生物学基础，并开发治疗方法，以确保这种疾病更持久的缓解。
研究结果
1.MSI2的表达标志着不同组织中癌症的起源细胞
为解析Musashi-2(MSI2+)干/祖细胞的致瘤潜力，作者开发了一种Msi2-CreERT2敲入小鼠(Msi2CreERT2/+)模型(图1A,B)，分析了组织中内源性MSI2的表达(图1D-F)。作者将Msi2-CreERT2小鼠与R26R-LSL-tdTomato杂交，以比较Cre活性与Msi2表达。他莫昔芬Cre激活后TdTomato的表达与MSI2的表达高度一致(图1G-J)，证实了这种敲入模型的保真度和特异性。肿瘤在不同组织之间的透视率不同，在被分析的小鼠中，80%患有肺癌，68%患有胃癌，52%患有脑瘤，45%患有胰腺肿瘤(图1P)。这些数据确定MSI2+细胞是多种癌症的起源细胞，并为理解MYC驱动的肿瘤的进展定义了一个新的模型。
图1 MSI2的表达标志着不同组织中癌症的起源细胞
2.一种多亚型胰腺癌模型的建立
在Msi2-Myc模型中发生在胰腺的肿瘤代表了胰腺癌亚型的多样性：PDAC、ASCP、ACC和间变性肿瘤。通过组织学和典型标记物确定肿瘤亚型(图2A-D)。对流式分选的上皮性肿瘤细胞进行的RNA测序显示，ACC和ASCP亚型拥有不同于彼此和起源细胞的转录景观(图2H)，在ASCP肿瘤中，Krt5、Krt6a和Trp63(图2I)和富集型(△N)Trp63(图2J)等鳞状标记物的表达较高。为确定来自Msi2-Myc模型的胰腺肿瘤与人类疾病之间的一致性，比较人类和小鼠ACC肿瘤的转录图谱，发现丰富和耗竭的通路都是保守的(图3A)。在耗竭通路中，人类ACC中常见的缺失或功能丧失突变的基因在小鼠ACC中也被耗尽(图3B)。小鼠和人ASCP肿瘤的转录图谱显示了丰富的途径的保守性(图3F,G)。在基因组水平上，小鼠和人类ASCP肿瘤表现出扩增基因的保守性(图3I)与Ras/Notch信号、MAP激酶信号和细胞凋亡等关键程序的调节有关(图3J)。
图2-3 一种多亚型胰腺癌模型的建立
3.胰腺癌亚型起源细胞和癌前状态的单细胞图谱
多亚型胰腺癌起源于共同的MSI2+细胞库，作者使用单细胞测序来跟踪MSI2+细胞(t=0)从癌前状态实时过渡到PDAC、ASCP或ACC肿瘤的分子轨迹(图4A-E)。为确定MYC如何启动转化，作者绘制了MYC诱导后细胞的转录多样性图。结果显示这些癌前细胞主要是大量未分化的细胞，同时表达导管和腺泡特征，并以Hmmr(透明质酸介导的运动受体)表达为标志(图4F)。相对于正常胰腺，细胞周期和染色质修饰基因(Hmgb2和Top2a)和多种致癌程序(Aldh1a1、RAN、Ube2c和KLF2)(图4H)在这些癌前病变中丰富。Metagene分析显示，在癌前细胞中，D1和D2的基因特征最丰富(图4J)，这表明更未分化的D1/D2导管细胞可能对MYC驱动的转化最敏感。
图4 胰腺癌亚型起源细胞和癌前状态的单细胞图谱
4.胰腺癌亚型的发展轨迹
scRNA-seq显示腺泡肿瘤由脂肪酶(Cel)和β-连环蛋白(Ctnnb1)定义(图5A)，并包含由CytoTRACE预测的分化较低的独特群体。CytoTRACE和差异表达分析分别确定了Hmgb2和Top2a在分化较低的群体中相关性最高和最丰富的基因。Moncle算法建立了从预测的前体群体(图5C，绿色细胞)到已建立的ACC细胞(图5C)的单一轨迹。为了了解导管/鳞状细胞系肿瘤是否从不同的起源和沿着不同的路径演变相对于ACC，分析了三个独立的肿瘤(图5D-I)，分叉导管/鳞状细胞瘤和p63+ASCP肿瘤中最不成熟的簇与ACC中最不成熟的簇相似：均表达Hmgb2/Top2a(图5E和图5H)，并含有最少的CNV。CNV随着分化程度的增加而逐渐积累，突出了肿瘤的基因组进化如何与其表观遗传控制的向分化谱系的进展平行的显著排列(图5E,H右)。在分叉的肿瘤中，PDAC和ASCP都起源于Top2a/Hmgb2+群体(图5E,F)，但在分支点上要么继续PDAC的命运(终点为Sox9、Ag2和Tff2)，要么转向一种鳞状命运(终点为Krt5、Krt6a、Krt15和Krt7) (图5F)。
图5 胰腺癌亚型的发展轨迹
5.Msi2-Myc小鼠的混合胰腺癌亚型来源于共同的癌前细胞池
基于上述计算数据，作者将重组细胞池原位移植到受体(NSG)小鼠的胰腺中(图6A)。对来自终末期肿瘤(n=3)的分选癌细胞进行的scRNA-seq显示，根据谱系特异性基因分类的腺泡和导管亚型具有显著的异质性(图6B,C)，表明这些细胞可以重建原发肿瘤的混合性质(图5A-I)。此外，未定植的祖细胞在这些混合瘤中持续存在(图6C)，反映了在原发自体肿瘤中发现的未分化细胞。这些发现表明在Msi2-Myc小鼠中，作为共同肿瘤前体的共同癌前细胞池可以产生多种亚型的胰腺癌(图6D,E)。所有scRNA-seq数据的整合进一步显示了细胞群体的转录重叠(图6F,G)。
图6 Msi2-Myc小鼠的混合胰腺癌亚型来源于共同的癌前细胞池
6.基因组和表观遗传学变化在ACC和ASCP规范中的差异贡献
ACC和ASCP肿瘤细胞显示了不同的保守CNV模式(图6H,I)，这增加了CNV可能在肿瘤生长过程中驱动亚型指定的可能性。虽然在不同的细胞池(图6K,L)中已经开始出现谱系特异的CNV(t=5)(图6J)，与线性特异的转录程序保持一致，但作者发现谱系特异的CNV发生在命运特异的基因表达之后，表明最终决定亚型的转录变化可能是由表观遗传机制启动的(图6J)。通过Single-cell ATAC-seq技术表明开放的导管和腺泡表观遗传景观导致了癌前细胞的杂交多系状态。
为了测试丰富的导管谱系的转录程序是否可以在功能上决定导管的命运，专注于RAS信号，发现它在导管命运的细胞中被扩增和转录上调(图7A,B)。在目前的Msi2-Myc模型中，MYC的表达足以在ASCP肿瘤发展的后期阶段激活突变的Kras信号(图7C)。因此，作者将Msi2-CreERT2；CAG-LSL-MycT58A小鼠与KrasLSL-G12D/+小鼠杂交，产生了Msi2-Myc；Kras小鼠(图7D)。与在MSI2+细胞中诱导MYC时发生的ACC和ASCP肿瘤不同，这些细胞中含有致癌Kras基因，导致了一种具有鳞状特征的非常侵袭性的PDAC形式(图7E-G)，但没有检测到ACC。表明RAS信号的激活足以将命运从ACC转移到导管/鳞状细胞系，并突显了计算模型的保真度和预测能力。
图6-7 基因组和表观遗传学变化在ACC和ASCP规范中的差异贡献
7、胰腺癌相关性的鉴定
shRNA介导的Ifne、Atf3、Hmmr和Sprr3基因的敲除最显著和持续地降低了来自Msi2-Myc鳞癌的两个独立癌细胞系的类器官形成能力(图8A)，突显了这些基因在鳞癌细胞持续维持中的重要性。HMMR无法检测到或在小鼠和人类正常胰腺中低表达，但在小鼠和患者来源的癌前病变的细胞膜中高度上调和定位(图8C,D)。shRNA介导的Hmmr在小鼠癌前细胞中的敲除显著减少了体外有机类物质的形成(图8E)，确定Hmmr在肿瘤形成的早期阶段是一种潜在的依赖。在晚期疾病中，抑制原代小鼠ASCP细胞中的Hmmr可使类器官生长减少50%以上(图8F)。HMMR在原发患者样本以及患者衍生的导管和鳞状细胞系中都高度表达，它在体外显著抑制了大多数人胰腺癌细胞的3D生长(图8H)。HMMR基因的敲除也使体内原位移植细胞系的生长减少了2倍以上(图8I)，肿瘤细胞的侵袭力显著降低，表明肿瘤细胞附近存在未受影响的正常组织(图8I)。
最后在体外，PDX肿瘤被分离并被GFP标记的慢病毒shRNA感染，然后重新移植到NSG小鼠的皮下(图8J)，证实HMMR是小鼠和人类体内腺鳞癌的关键功能依赖(图8K)。综上，数据表明Msi2-Myc模型可用于识别ASCP的功能依赖关系，并为开发截获和靶向最致命的胰腺恶性肿瘤亚型的方法提供基础。
图8 胰腺癌相关性的鉴定
结论
研究表明MYC优先触发最不成熟的MSI2+胰腺细胞转化为多谱系癌前细胞。这些癌前细胞随后通过激活不同的转录程序和大规模的基因组变化分化形成胰腺癌亚型，而Ras等特定信号的强制表达可以重定向亚型规范。多种胰腺癌亚型可以从一个共同的MSI2+细胞池中产生，并提供了一个强大的模型来理解和控制形成胰腺癌不同命运的程序。
参考文献
Nirakar R, Michael H, Cynthia M. Q, et al. Single-cell mapping identifies MSI+ cells as a common origin for diverse subtypes of pancreatic cancer. Cancer Cell, 2023,41: 1–17.
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